蛋白质组学(英语：proteomics，又译作蛋白质体学)，是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。目前研究空间蛋白质组学分析的方法主要有两种：基于细胞器分离的质谱法和基于成像的蛋白质定位方法。
近期上海同济大学的朱小立研究团队在国际期刊《ScienceAdvances》发表题为“Computer-aideddesignofreversiblehybridizationchainreaction(CAD-HCR)enablesmultiplexedsingle-cellspatialproteomicsimaging”的研究文章，报告了一种一种新的单细胞空间蛋白质组学成像技术。
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受目前检测通量与检测技术灵敏度的限制，单个细胞的原位空间蛋白质组学分析还没有实现。免疫核酸扩增技术的最新进展为解决这一问题提供了巨大的机会。在此，我们报告了一种创新的杂交链式反应（HCR）技术，它涉及计算机辅助设计（CAD）和可逆组装。其中，CAD实现了高度复用的HCR，其序列数据库可以并行工作，而可逆DNA自组装允许“未组装-组装-去组装”状态的连续切换。
因此，CAD-HCR已被成功用于单细胞空间蛋白质组学分析。CAD-HCR的荧光信号与传统的免疫荧光相当，并且与目标蛋白的丰度呈正相关，这有利于蛋白质的可视化。这里开发的方法扩大了单细胞分析和蛋白质组学研究的工具箱，也扩大了HCR的性能和应用。
研究结果
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可逆HCR的CAD
在一个典型的HCR中，采用两个发夹式寡核苷酸。一个单链DNA启动子（缩写为"I"）可以打开其中一个发夹，暴露出一个以前未识别的单链区域，可以打开另一个发夹。该反应循环进行，导致形成有缺口的双链并发体。以前的报告显示，数百到数千个发夹构件可以被组装起来。为了将HCR与DNA交换技术相结合，这里开发了一种可逆的HCR。我们采用了两种策略，命名为间隙式HCR（gHCR）和尾部HCR（tHCR）。
对于gHCR，一个额外的单链区域被插入第一个发夹的环中，而对于tHCR，额外的区域被置于发夹的3′端。在启动子启动后，两个发夹（即H1和H2）可以组装成双链的协合体，在gHCR和tHCR的情况下分别有重复的空隙或尾巴。为了分解协合体，额外的区域（即间隙和尾巴区域）作为一个脚点与寡核苷酸垫圈（缩写为"W"）结合，反过来，它可以与H2竞争，通过链位移与H1杂交。
图1：可逆复用的gHCR和tHCR及其在空间蛋白质组学成像分析中的应用概述
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可逆的HCR在体外的表征
从序列数据库中随机抽取10组H1、H2、I、W，分别建立10组gHCR和tHCR作为模型。采用琼脂糖凝胶电泳法研究gHCR和tHCR的组装和拆分情况。就tHCR而言，图2A显示相应的tH1和tH2在有正交启动子的情况下形成双链扩增并发体（每组的第二泳道），而在没有启动子的情况下可以观察到tH1和tH2单体的清晰条带（每组的第一泳道）。
在组装好的tH1和tH2中加入洗涤剂，会进一步导致concatemers的分解，并形成由tH1/tH2/tW组成的三元片段（每组的第三条泳道），这些片段的分子量比单体大。在gHCR的情况下也得到了类似的结果，表明它们都能在体外如预期的那样工作。S1显示，只有正交的启动子能触发相应的HCR，而其他启动子则完全无效。
图2：tHCR和gHCR在体外的表征
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可逆的HCR用于原位成像的可行性
接下来，通过将HCR与免疫识别共轭，研究了可逆HCR用于空间蛋白质组学成像的可行性。使用化学交联剂[磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(sulfo-SMCC)]合成PA-DNA共轭物。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）用库马西亮蓝染色来分析，通过观察一抗（β-肌动蛋白）与DNA启动剂结合后的表观分子量的小变化来证实结合的成功。PA-DNA共轭的比例被计算为约为1:2。通过用荧光基团标记引发剂，并在通过超滤分离后测量共轭物的荧光强度，计算出PA-DNA共轭比率约为1:2。
然后采用PA-DNA共轭物进行荧光成像。结果显示，所有9个制备的共轭物都可以用于常规的免疫荧光分析，这表明初级抗体保持了活性和免疫原性，具有高特异性和亲和力。同时，共轭物的DNA启动剂保持了其启动HCR的活性，呈现出细胞蛋白的原位荧光成像信号的放大。共定位研究表明，可逆的HCR可以与免疫荧光很好地共定位，证明了可逆的HCR具有良好的特异性。
图3：可逆的HCR在原位成像中的可行性
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扩增倍数的比较
进一步研究了可逆的HCR的扩增效果。首先，将两个HCR发夹中的一个用荧光染料修饰，以验证放大效果。如图4所示，对于四个独立的蛋白质，包括β-肌动蛋白、Ezrin、电压依赖性阴离子通道（VDAC）和α-管蛋白的成像分析，与未放大组相比，tHCR和gHCR的荧光信号都增强了约65倍。tHCR和gHCR的荧光信号与常规免疫荧光相当，有利于后续成像。此外，通过用荧光染料修饰两个HCR发夹（H1和H2），可以实现额外的信号放大，表明可逆HCR在放大效率上的可扩展性。
如我们以前的研究所述，研究了用苄基-α-N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）处理的密歇根癌症基金会-7（MCF-7）细胞，一种粘蛋白1（MUC1）的特定抑制剂。当目标蛋白表达改变时，蛋白丰度和可逆HCR的荧光强度之间存在正相关，这与现有报道一致。虽然一般认为单个HCR的组装程度无法精确控制，但这里的结果表明，可逆HCR可以用于目标蛋白的半定量分析。此外，随着HCR技术的发展，最近报道了一种通过在发夹的双链中引入碱基对错配来控制HCR组装度的方法，这可能会提高HCR的定量性能。
图4：通过用荧光染料修饰H2，利用可逆的HCR进行放大成像
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关于CAD-HCR的可逆性研究
接下来研究了可逆的HCR在扩大多路成像方面的能力。为了实现这一目标，应该满足一个前提条件。即在每个染色和成像周期后，必须彻底清洗荧光体标记的HCR浓缩物，以避免在随后的周期中出现残留的荧光信号。两组HCR（tHCR-1和tHCR-2）被用于两个目标蛋白（β-肌动蛋白和Ezrin）的循环成像在10个周期中，成像结果显示出几乎相同的染色模式，这表明染色和解染周期是在不影响细胞形态的情况下实现的）。对图5B的荧光强度的定量分析也显示了在循环过程中稳定的信号输出，证明一抗的抗原性和引发剂的杂交性也没有受到影响。
循环过程中的稳定信号输出表明，当反应时间被严格控制时，整体信号是可控的。据推测，可逆的HCR通过消除不可逆的信号衰减，赋予了样品高度的可重复使用性，这是传统的免疫荧光技术所不能达到的。它在各种实际应用中很有价值，特别是对于长期重复分析珍贵的临床样品和实验样品（外泌体、细胞、组织、蛋白质芯片等）。
图5：通过可逆的HCR进行循环染色和解染
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CAD-HCR辅助的单细胞内空间蛋白质组学成像
最后，通过使用可逆的HCR，我们对分布在单个细胞内不同亚细胞位置的九个蛋白质进行了多重成像。这里需要注意的是，同一组三个正交HCR不能在成像周期中重复使用，因为在每个成像周期后，抗体-引发剂DNA共轭物不能被洗掉，如果应用同一组三个正交HCR，它们会在下一个周期引发相应的正交HCR，导致错误的输出信号。图6B显示了三个周期成像后九种蛋白质的独立荧光图像，这些图像可以被重建并重新着色以获得一个综合图像。图6C中用红色虚线圈出的单个细胞也在图6D中逐层显示，以显示每个蛋白质的定位。如图所示，九个蛋白质的分布与它们的理论位置很吻合。
通过简单地改变初级抗体-DNA共轭物，这种可逆的HCR可以扩展到循环成像和其他蛋白质的多重成像。在单细胞分析和全能分析的时代，可逆HCR辅助的蛋白质组学分析被认为对细胞信号传导、蛋白质-蛋白质相互作用网络和珍贵疾病诊断领域的研究非常重要。此外，由于反应系统的温和性，这种可逆的HCR可以扩展到活细胞中膜蛋白的分析。
图6：单个细胞内九种蛋白质的多重染色
研究总结
总而言之，结合CAD技术，研究团队开发了一种可循环和可逆的HCR技术，这种创新的HCR系统成功地应用于单细胞水平的空间蛋白质组学的敏感成像分析，目标蛋白的半定量和亚细胞定位可通过常规的激光共聚焦显微镜实现，可广泛用于大多数实验室。
通过与免疫识别结合，这种创新的HCR系统成功地应用于单细胞水平的空间蛋白质组学的敏感成像分析。CAD能够为可并行工作的多路复用HCR构建可扩展的序列数据库，而可逆tHCR和gHCR使得在单个细胞上对多路复用蛋白质进行循环成像成为可能。展望未来，它在临床诊断和生物医学研究中具有更大的应用潜力。
