白癜风的治愈 https://disease.39.net/bjzkbdfyy/210623/9096825.html本文选自中国工程院院刊《Engineering》年第6期
作者：曹霞，SushilaMaharjan，RamlaAshfaq，JaneShin，YuShrikeZhang
来源：BioprintingofSmall-DiameterBloodVessels[J].Engineering,,7(6):-.
编者按
血管是把氧气和营养物质输送到组织中并从中携带二氧化碳和其他代谢废物的通道。生物工程血管在再生医学和药物筛选等应用中的需求越来越大，但生物工程血管移植物的真正可用性仍然有限。三维生物打印技术为移植和再生提供了一种潜在的血管或血管化组织结构的制备方法。
中国工程院院刊《Engineering》年第6期刊发《小口径血管的生物打印进展》，总结了不同血管的基本生物学特性，以及用于制备血管和血管化组织结构的3D生物打印方法和生物墨水设计，重点探讨了小口径血管。文章还讨论了不同的生物材料及其生物相容性、可打印性、力学性能等，以及在制备合适的生物墨水以满足小口径血管3D生物打印的关键要求方面所面临的挑战，最后探讨了未来可能的发展方向。
一、引言
血管是把氧气和营养物质输送到组织中并从中携带二氧化碳和其他代谢废物的通道，主要包括三种类型：动脉、毛细血管和静脉，它们在结构组成、尺寸和生理功能上都不同。根据血管内径（innerdiameter,ID），可将其分为微血管（ID1mm）、小血管（ID=1~6mm）和大血管（ID6mm）。
主动脉是人体内最大的血管，它将含氧血液从心脏输送到身体的不同部位。主动脉分支成动脉，动脉进一步分支成更小的血管，称为小动脉。小动脉最终分支成细小的毛细血管，它们是最小的血管。毛细血管可允许氧气、营养素、二氧化碳和其他代谢废物在血液和局部组织之间扩散。毛细血管在小动脉和小静脉之间形成一个网络，其中小静脉是非常小的静脉，负责从毛细血管中收集脱氧血液，并将其输送到逐渐增大的静脉中，最后回流进入心脏。
尽管动脉和静脉具有不同的功能，但它们的血管壁都是由不同细胞和细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）组成。这些细胞和ECM主要分为三个层：内层内膜、中层中膜和外层外膜[图1（a）]。毛细血管（ID10m）由单层内皮细胞（endothelialcells,EC）组成，形成血管的内层（内膜），并被基膜和周细胞包围[图1（b）]。小动脉和小静脉（ID=10~m）由内皮细胞内层（内膜）和周围的平滑肌细胞（smoothmusclecells,SMC）层（中膜）组成[图1（b）]。动脉和静脉（IDm）由内皮细胞内层（内膜）、中间的平滑肌细胞层（中膜）及成纤维细胞和ECM成分外层（外膜）组成[图1（b）]。血管的不同层及其细胞组成、直径、ECM成分和功能见表1。
图1血管的一般结构和类型。（a）组成动脉壁和静脉壁的各个层的结构示意图。经MaryHammes许可，转载自参考文献，。（b）不同类型血管的细胞组成、直径和厚度。表中的条状图形代表血管中各个层所占的比例。毛细血管包括被周细胞包围的内皮细胞内层；小动脉/小静脉由一层薄薄的平滑肌细胞层所包围的内皮细胞内层构成；动脉/静脉由内皮细胞内层和成纤维细胞外层组成，内皮细胞形成的内层周围有致密的平滑肌细胞层。经Nature许可，转载自参考文献，，以及经AmericanPhysiologicalSociety,Inc.许可，转载自参考文献，
内皮细胞和血管平滑肌细胞是组成动脉和静脉的关键细胞类型。这些细胞类型的相互作用不仅在血管系统的发育中起着关键作用，而且在维持血管内稳态方面也起着关键作用。血管的内皮细胞内层在表型和功能上具有显著的异质性，这是由于它们在血流过程中经历了不同的微环境以及不同水平的压力和剪切应力。内膜中的内皮细胞内层起到了严密调节动态屏障的作用，可防止血液泄漏到周围组织和间质中。它们也在一些生理过程中发挥关键作用，包括调节血流和通透性、炎症部位循环免疫细胞的跨内皮迁移、维持血管张力和止血作用。血管中内皮细胞沿纵向排列，平滑肌细胞沿圆周方向排列，并由弹性纤维隔开。平滑肌细胞具有收缩表型，通过主动收缩和舒张维持血管内稳态。此外，平滑肌细胞还具有分泌表型，负责ECM的合成和修复，从而调节血管壁的结构。
冠心病和外周动脉疾病导致全球死亡率和发病率逐年增加，预计到年，年死亡率将增至万。目前常用的血管重建方法包括：血管成形术、支架植入术和外科旁路移植术。对于旁路移植来说，治疗冠状动脉和周围血管疾病等的金标准仍然是使用自体动脉或静脉（主要是胸内动脉或隐静脉）。然而，健康的自体血管并不容易获取，需要进行侵入性采集，并且长期通畅率也很低。采用合成血管移植物替代自体血管，可成功替换中型和大型血管。合成血管主要由聚对苯二甲酸乙二酯或聚四氟乙烯制成。尽管这些合成移植物已被证明对中型和大型血管具有有效的长期通畅性，但由于仍存在生物力学特性不匹配、生物相容性差、血栓形成、微生物污染和通畅率差等特点而受到限制。考虑目前血管类导管的局限性，以及包括冠状动脉和外周动脉在内的小口径血管的病理事件，医疗领域一直存在对具有降低小口径血管疾病发病率潜力的生物工程血管的临床需求。
随着血管生物工程的发展，三维（3D）生物打印技术已成为有潜力的血管生成方法，生成的血管具有在体内生长、重塑、修复血管疾病的能力。在过去的几年里，不同的3D生物打印技术和策略被报道用以制造仿生血管，并不断得到完善和改进。本文综述了应用于血管工程的各种生物打印技术，包括挤出生物打印、喷墨生物打印、激光辅助生物打印、光固化生物打印等，以及它们的优点和局限性。我们还讨论了不同的生物材料及其生物相容性、可打印性、力学性能等，以及在制备合适的生物墨水以满足小口径血管3D生物打印的关键要求方面所面临的挑战。最后，我们探讨了未来可能的发展方向。
二、三维生物打印
3D生物打印技术在血管组织工程领域取得了重大进展。要实现与天然血管的整合，具有长期通畅性的工程血管的基本要求包括：适当的力学性能、高顺应性、重塑能力和抗血栓形成能力。理想生物工程血管特别是小口径血管的要求见表2。3D生物打印可以将生物材料和活细胞（统称为生物墨水）精确沉积在指定位置，形成与天然血管非常相似的结构。生物打印可通过各种方式、策略以及来源广泛的生物墨水成功制备血管组织。
最常用的生物打印方式包括：喷墨打印、挤出打印、激光辅助打印和光固化生物打印。喷墨打印是一种非接触生物打印技术，生物墨水液滴从墨盒中以预设尺寸进行沉积，生成伪3D或3D结构[图2（a）]。挤出生物打印是最常用的生物打印方法，其中生物墨水通过由打印头形成长丝的形式进行连续分配[图2（b）]。与喷墨打印和挤出打印相比，激光辅助生物打印不太常见，该方法使用激光脉冲将生物墨水从供体载玻片沉积到受体基板上[图2（c）]。基于光固化的生物打印，通常采用立体光刻或数字光处理的形式，通过精确控制的光掩模在垂直移动的平台上逐层聚合光敏聚合物，以创建具有所需的3D结构[图2（d）]。
每种模式都有其优缺点，并且在一些参数（如生物墨水和基质的选择、结构的复杂性和制造的数量）上有所不同。喷墨生物打印具有生物墨水沉积速度快和分辨率高等优点；然而，由于分配层的不稳定性，其容量通常有限。挤出生物打印是一种成本效益高且易于控制的方法。但这种方法打印速度相对缓慢，且分辨率较低。激光辅助生物打印具有制造速度快、分辨率高和生物相容性良好的特点，但仪器成本较高。基于光固化的生物打印也具备分辨率高和快速制造的特点，但仪器比较复杂。根据血管的不同形状和大小，不同的3D生物打印模式已被应用于体外制造具有不同功能的血管系统[图2（e）]。
图2具有代表性的3D生物打印方法。（a）喷墨生物打印法示意图；（b）挤出生物打印法原理图；（c）激光辅助生物打印法原理图。经Wiley许可，转载自参考文献，。（d）光固化生物打印法示意图。经XuanyiMa等许可，转载自参考文献。（e）血管的层次结构和当前的生物打印技术示意图，这些技术已被用于制造各种不同的血管。经Elsevier许可，转载自参考文献，
三、生物墨水的设计
为了实现生物工程血管系统的功能，其结构和完整性必须与天然血管相似（两者都高度依赖于周围ECM的力学性能和化学信号）。ECM是各种细胞因子及生长因子的贮存器和调节剂，其在血管形成过程中为内皮细胞的组织和稳定提供结构支持。因此，ECM特性，如密度、异质性和硬度在调节血管形态发生、毛细血管网络形成和屏障完整性方面发挥着关键作用。
组成不同血管层的主要ECM成分如表1所示。内皮细胞排列在血管腔内层，血管腔位于基底膜上，基底膜主要由胶原、层黏连蛋白、纤维连接蛋白、巢蛋白、硫酸肝素蛋白多糖和其他大分子组成。中膜是平滑肌细胞的中间层，由含有纤维胶原I、III、V的胶原质ECM，层黏连蛋白，弹性蛋白，纤维连接蛋白，透明质酸和核心蛋白聚糖组成。内膜和中膜被内弹性膜分开。外膜层是结缔组织和成纤维细胞的最外层，包括弹性蛋白、I型和IV型胶原以及蛋白聚糖。
表1血管的一般结构和功能
因此要想成功地在体外制造血管，特别是直径较小的血管，需要更高分辨率的生物打印方法与适当的生物墨水配方之间的协同作用。生物墨水可以提供结构和机械支持，以维持细胞活力，同时促进移植或血管新生。生物墨水是由生物材料、细胞、营养素、生长因子组成，应该模拟组织的最佳ECM环境。生物墨水的设计应考虑主要的ECM组成，这对于血管的3D生物打印至关重要，因为它不仅决定了生物打印的分辨率，还决定了血管的完整性和其他关键的生物特性。
表2理想的生物工程小口径血管需满足的要求
用于血管3D生物打印的生物墨水最常用的配方是基于水凝胶前体的配方，原因是这些配方具有优异的生物相容性、可调节的硬度和孔隙率、模拟天然ECM的能力以及与不同生物打印模式相兼容的特性。已有研究对几种天然和合成生物材料进行了单独或组合使用，设计出类似于ECM理化性质的生物墨水。广泛用于体外血管组织工程的天然生物材料，包括明胶、胶原、弹性蛋白、纤维蛋白、透明质酸、琼脂糖、海藻酸和基质胶等。基于天然生物材料的水凝胶为细胞黏附、生长和增殖提供了适宜的微环境；最重要的是，它通常不会对宿主造成慢性炎症或毒性。然而，天然水凝胶的弱机械强度无法承受生理压力，因而限制了其在血管组织工程中的应用。因此，已有研究将各种合成聚合物与天然生物材料相结合，原因是合成聚合物具有精确控制的力学性能、孔隙率、再现性、结构多样性、刚度和生物降解性。常用的合成聚合物包括聚乙二醇（PEG）、聚甲基丙烯酸羟乙基酯和聚乙烯醇（PVA）。这些复合材料可以提供良好的机械支撑，提高打印结构的机械强度。然而，由于缺乏生物相容性、细胞黏附性差、释放有毒副产物以及降解过程导致力学性能下降，合成聚合物的应用受到限制。
为了克服这些限制并获得具有理想性能的生物墨水，人们采用了基于化学、机械、物理和生物改性的不同方法来探索功能化。最常用的功能化方法之一是将甲基丙烯酰基引入聚合物，如明胶、胶原和透明质酸。这种方法产生的光聚合物可以按要求形成力学性能稳定的结构。这些聚合物的机械强度很大程度上取决于甲基丙烯酰改性程度和光照暴露程度。甲基丙烯酰改性程度越高，光照时间越长，结构的强度就越高，降解率就越低。应用两种或两种以上交联机制有助于显著提高结构完整性和机械强度。例如，当使用维生素B2（核黄素）共价交联脱细胞ECM（decellularizedECM,dECM）生物墨水，然后通过胶原纤维形成热触发物理交联时，能获得更好的力学性能。与单独交联的结构物相比，这种两步交联机制表现出更高的储能模量，表明每种交联机制都有助于提高结构物的整体力学性能。另一方面，混合生物墨水材料也可以达到同样的效果。例如，在明胶甲基丙烯酸（gelatinmethacryloyl,GelMA）中添加明胶提高了交联度，从而改善了力学性能。此外，当其他聚合物，如甲基纤维素、四臂聚乙二醇丙烯酸酯（4-armPEG-tetra-acrylate,PEGTA）、具有三季戊四醇核的八臂聚乙二醇丙烯酸酯（8-armPEG-acrylatewithatripentaerythritolcore,PEGOA）、透明质酸、PVA和羟基磷灰石加入时，它们可以增强剪切变稀行为和（或）提高生物打印后的形状保真度。
此外，将各种生物活性物质，如纤维蛋白（或纤维蛋白原和凝血酶）和聚赖氨酸添加到生物墨水中，可以诱导或增强其生物活性。纤维蛋白是一种纤维蛋白原的聚合物，在凝血酶存在下形成纤维状、黏弹性和多孔水凝胶。纤维蛋白已被证明可以提高生物墨水的生物黏附性和生物活性。带正电荷的聚赖氨酸也被用于通过增加与带负电荷的细胞膜的静电相互作用来增强细胞黏附性。
同样，非黏附性水凝胶的生化性能也可通过黏附肽配体的修饰得到改善。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-asparticacid,RGD）肽是最常用的肽配体，在细胞黏附、扩散和迁移中起着关键作用。例如，与未经RGD修饰的水凝胶相比，与RGD肽共轭的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-diacrylate,PEGDA）水凝胶增强了细胞的黏附性。进一步说明，植入的PEGDA水凝胶中含有的RGD肽可调节体内细胞黏附性、炎症反应、纤维包封和血管形成。RGD肽也被引入其他各种水凝胶形成聚合物中，如透明质酸、海藻酸、壳聚糖和PEG水凝胶，用来改善细胞行为。
多种生长因子，如成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactor,FGF）、血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）以及转化生长因子-α（transforminggrowthfactor-α,TGF-α）和TGF-β已被确定是血管生成的诱导因子。例如，FGF-2和VEGF用于刺激内皮细胞的增殖、运动和分化，是血管形成的关键介质。在体内和体外研究中，VEGF被物理地包封在PEG水凝胶中，以释放响应细胞分泌的蛋白酶，从而增强血管形成。此外，在ECM蛋白质中发现了一些生长因子结合位点，如纤维连接蛋白、纤维蛋白原、细胞黏合素C和玻璃体蛋白。已有研究表明与这些ECM蛋白结合的VEGF可促进糖尿病患者的伤口和骨缺损的愈合。虽然其中一些策略可能尚未与血管生物打印中所使用的生物墨水相结合，但它们在血管生物打印中的应用似乎显而易见。
最近，一些研究表明改变基质黏弹性对细胞行为产生影响，包括通过改变聚合物的共价交联和（或）浓度来降低丙烯酰胺水凝胶的模量，通过改变亲和力不同的共价交联剂来调节PEG水凝胶中的应力松弛，或使用海藻酸水凝胶的共价和（或）物理交联。这些研究表明，在二维（2D）培养中，改良的耗能模量和基质可缓慢增强间充质干细胞（mesenchymalstemcell,MSC）的细胞铺展和成骨分化，增强的基质应力松弛改善了2D培养细胞的扩散和增殖，并使细胞适应相关的3D培养形态。同样，研究表明，细胞在弹性和黏弹性水凝胶中表现不同，生物材料的弛豫行为随着细胞的相互作用而改变，细胞行为改变包括扩散、增殖和分化。MSC分化依赖于3D水凝胶的初始弹性模量，而在弹性水凝胶中，MSC分化对水凝胶的刚度缺乏敏感性，表明细胞应力松弛对ECM中的力学性能具有重要意义。这些见解可能有助于血管生物墨水的设计，以改善细胞行为和血管功能。
四、小口径血管生物打印的研究进展
小口径血管包括小动脉和小静脉。小动脉腔调节毛细血管中的血流，小静脉是从毛细血管接收血液的最小静脉，在血液和组织之间的氧气和营养物质交换中起着重要作用。通常很难用人工方法构建小口径血管。然而，利用生物打印技术的优势，可以获得更复杂的和生理相关的小口径血管结构。
（一）挤出生物打印
挤出生物打印是一种经济高效且常用的生物打印方法，该方法以一种逐层同步打印头空间运动的方式从打印头分配生物墨水。挤出生物打印机通过打印头以气动或机械方式连续分配生物墨水，可与多种高黏度生物墨水兼容。海藻酸已广泛用于血管组织结构的挤出生物打印。例如，海藻酸可以与中心同时打印的氯化钙（CaCl2）溶液物理交联，以确保生物打印空心结构的保真度。采用外层针（ID=m）和内层针（ID=m）制备同轴打印头，利用该打印头，将海藻酸钠溶液（浓度分别为3%、4%和5%）包封的原代人脐静脉平滑肌细胞（humanumbilicalveinSMC,HUVSMC）生物打印成可灌注血管。利用海藻酸钠溶液（浓度为5%）打印的血管的管腔平均直径分别为（±27）m和（±16）m。同样，采用同轴打印头辅助挤出生物打印方法，利用包封在海藻酸钠（浓度为2%~5%）和CaCl2（浓度为2%~5%）溶液的L小鼠成纤维细胞，可实现直径均匀、机械强度高、结构完整性好的中空海藻酸钙纤维的3D生物打印。同轴打印头由外层针（ID=m）和三个不同内层针（ID分别为m、m、m）组成。生物打印空心血管的大小取决于内层针的大小以及海藻酸钠和CaCl2的流速和浓度。当使用海藻酸钠溶液（流速为1mL·min1、浓度为2%）和CaCl2（流速为2mL·min1、浓度为4%）时，生物打印海藻酸钠空心血管的平均ID和外径（outerdiameter,OD）分别为m和m。
在另一项研究中，使用带有同心针的多层同轴打印头与包封人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinEC,HUVEC）和人间充质干细胞（humanMSC,hMSC）的生物墨水来制造可阅读的血管组织结构。该研究中的生物墨水由海藻酸钠（浓度为2%或3%）、PEGTA（浓度为2%或3%）和GelMA（浓度为5%或7%）预聚物溶液组成。PEGTA的加入增强了生物打印血管组织结构的力学性能。根据所使用的内层针（ID=0.~0.mm）和外层针（ID=0.~0.mm）的大小，优化混合生物墨水（浓度为3%的海藻酸、2%的PEGTA和7%的GelMA），生物打印不同尺寸的空心管。生物打印空心管的平均OD为~1m、ID为~0m、壁厚为60~m。混合的生物墨水经证明可支持生物打印的血管结构中包封的HUVEC和hMSC的扩散和增殖，从而形成生理相关的血管组织结构[图3（a）]。最近，利用多通道同轴挤出系统可进一步制备多层中空血管组织。该系统由同轴打印头（由三个同心针组成的芯部针，ID=0.mm）、中层针（ID=mm）和外层针（ID=1.mm）组成；生物墨水由GelMA（浓度为5%或7%）、海藻酸钠（浓度为2%或3%）和PEGOA（浓度为1%或2%）组成；HUVEC打印在中间层；平滑肌细胞打印在外层。当使用具有最佳打印性能的混合生物墨水（7%的GelMA、2%的海藻酸钠和2%的PEGOA）时，测量内腔的平均直径为（±52）m、外腔为（±63）m、内外壁厚度分别为（62±10）m和（94±10）m[图3（b）]。生物打印的血管组织表现出不同层次和不同表型的细胞异质性，表明血管样组织的形成。
图3（a）小口径血管的同轴生物打印：（I）多层同轴打印头和各种空心血管制造示意图；（II）血管床的生物打印工艺和制作示意图；（III）示意图和荧光显微照片显示不同直径的生物打印血管；（IV）注射红色荧光微球前后的生物打印血管的荧光照片；（V）血管管状结构的共聚焦图像显示，在培养14d（上排）和21d（下排）后，MSC表达平滑肌α-肌动蛋白（α-SMA），HUVEC表达分化簇31（CD31）。细胞核用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。经Elsevier许可，转载自参考文献，。（b）多层空心血管生物打印用多通道同轴挤出系统示意图（I）；双层空心血管（上排）的代表性荧光显微照片以及单层和双层空心血管的横截面图（下排）（II）；第4天，由用绿色荧光标记的人膀胱内上皮细胞和用红色荧光标记的人膀胱外平滑肌细胞组成的生物打印血管的荧光显微照片（III）；（IV）免疫染色血管的共聚焦显微照片，其中内皮细胞和血管内皮细胞表达CD31（绿色），平滑肌细胞表达α-SMA（红色）。经Wiley许可，转载自参考文献，。
在最近的一项研究中，研究人员利用三层同轴打印头（ID分别为2.mm、2.mm、3.mm），通过挤出生物打印技术制备了包含内皮细胞层和肌肉细胞层的小口径血管结构，其中将包封在来源于血管组织的ECM（vasculartissue-derivedECM,VdECM，浓度为3%）/海藻酸（浓度为2%）水凝胶中的HUVEC和人主动脉平滑肌细胞（humanaorticSMC,HAoSMC）作为生物墨水。所得到的血管ID约为2mm，由一层薄的HUVEC层（约50m厚）组成，外面包封一层较厚的平滑肌细胞层（~0m厚）。将血管植入大鼠腹主动脉21d。血管移植物可重塑平滑肌层并与宿主组织融合，而且其血管通畅、内皮完整。类似地，使用3D打印的微流控共挤装置，可制备内径分别为（±11）m、（±11）m、（±12）m的长期可灌注海藻酸钙血管，随后将共包封在基质凝胶（体积分数为35%）中的HUVEC和血管平滑肌细胞接种在海藻酸钙血管上。所得到的血管具有正确的管腔结构，且具有内皮细胞内层和平滑肌细胞的外鞘。这些血管表现出血管的功能特性，包括静止性、可灌注性和对血管收缩剂的收缩性。
另一项研究展示了同轴挤出打印小口径血管，其中人冠状动脉平滑肌细胞（humancoronaryarterySMC,HCASMC）被包封在儿茶酚功能化的GelMA（GelMA/C，质量分数为20%）生物墨水中。含有HCASMC的GelMA/C生物墨水通过较大的外层针（直径为m）挤出，而PluronicF（质量分数为30%）和高碘酸钠（23.4nmol·L–1）中的HUVEC通过较小的内层针（直径为m）挤出。根据使用的同轴打印头，生物打印血管的ID为~1m，壁厚为~m。将生物打印的血管进一步植入非肥胖型糖尿病严重联合免疫缺陷（nonobesediabetic-severe
