在人类早期妊娠期间，子宫粘膜转变为蜕膜，胎儿胎盘在蜕膜中植入，胎盘滋养细胞在蜕膜中与母体细胞相互融合并交流。滋养体-蜕膜相互作用是妊娠常见疾病的基础，包括先兆子痫和死产。在这里，我们分析了妊娠头三个月胎盘中约70,个单细胞的转录组，这些单细胞与母体血液和蜕膜细胞相匹配。人体蜕膜的细胞组成揭示了位于不同蜕膜层的血管周围和基质细胞亚群。
蜕膜自然杀伤细胞有三个主要亚群，它们具有独特的免疫调节和趋化因子特征。我们开发了一个配体-受体复合物库和一个统计工具，以预测通过这些分子相互作用的细胞-细胞通信的细胞类型特异性。我们的数据确定了许多调节相互作用，防止有害的先天或适应性免疫反应在这种环境。我们的母胎界面的单细胞图谱揭示了蜕膜和胎盘的细胞组织，以及对胎盘和生殖成功至关重要的相互作用。
引言
在妊娠早期，子宫的粘膜衬里——子宫内膜——在孕激素的影响下转变为蜕膜。蜕膜化是一个复杂而精心安排的分化程序的结果，包括粘膜的所有细胞元素:基质细胞、腺细胞和免疫细胞，最后包括独特的蜕膜自然杀伤细胞。胚泡植入蜕膜，在动脉连接建立之前，最初子宫腺体是胎盘组织营养的来源。
植入后，胎盘外滋养细胞(EVT)通过蜕膜侵入螺旋动脉，破坏平滑肌介质，将动脉转变为高导电性血管5。平衡调控EVT的侵袭是妊娠成功的关键:为了确保资源正确分配给母亲和婴儿，必须充分转化动脉，但必须防止过度侵袭。蜕膜的关键调节作用从蜕膜缺失时发生的危及生命的、不受控制的滋养细胞侵袭中显而易见，如胎盘植入先前的剖腹产疤痕时。
EVT有一个独特的人类白细胞抗原(HLA)特征:它们不表达显性T细胞配体，I类HLA-a和HLA-b，或II类分子8,9，但表达HLA-g和HLA-e和多态HLA-cI类分子。这些滋养细胞HLA配体具有由显性蜕膜免疫细胞(即dNKs)表达的受体，包括母体杀伤免疫球蛋白样受体(KIRs)，其中一些与HLA-c分子结合10,11。母体KIRs和胎儿HLA-C基因变异的某些组合是与妊娠疾病，如滋养细胞浸润不足的子痫前期有关。然而，我们对早孕期蜕膜细胞相互作用支持的详细作用还缺乏详细了解。
在本研究中，我们使用单细胞转录组技术全面解析胎盘形成时妊娠早期蜕膜中参与母胎沟通的细胞状态。然后，我们使用一个计算框架来预测细胞类型特异性配体受体复合物，并提供了一个新的复合物数据库。通过将这些预测与空间原位分析相结合，我们构建了一个详细的人类蜕膜-胎盘界面的分子和细胞图谱。
孕产妇和胎儿细胞在怀孕早期
我们结合droplet-based封装和plate-basedSmart-seq单细胞转录组配置文件从母胎界面(11蜕膜和5胎盘从6日至14日孕周)和六个匹配外周血单核细胞(图1a,b,补充表1、2,扩展数据图1)。在计算质量控制和集成的转录组技术,我们对组合数据集进行基于图的聚类(参见方法)，并使用集群特异性标记基因对聚类进行注释(图1c，扩展数据图2,3a-d，补充表2)。我们使用来自的全长转录组研究T细胞组成和克隆扩增Smart-seq2，根据这些数据重建T细胞受体序列，结果显示蜕膜区CD8T细胞扩增(图1d)。
我们将每个细胞的单细胞rna测序(scRNA-seq)序列与母细胞和胎儿基因组DNA中重叠的单核苷酸多态性进行比对，将细胞指定为胎儿细胞或母细胞(图1e，扩展数据图3e)。与预期的一样，蜕膜样本中大部分是母体细胞，少数是胎儿HLA-G+EVT。胎盘标本以胎儿细胞为主，除了母体巨噬细胞(M3簇)表达CD14、SA9、CD、CD68和CSF1R(扩展数据图3f)。这些可能来自于合并到合胞体中的血液单核细胞。
Cellphonedb预测的细胞通讯
为了系统地研究胎儿和母体细胞在蜕膜-胎盘界面的相互作用，我们开发了一个知识库。
我们的知识库形成了一个计算方法的基础，以识别生物学相关的配体-受体复合物。我们考虑每个细胞类型内的配体和受体的表达水平，并使用经验洗牌来计算哪些配体-受体对表现出显著的细胞类型特异性(扩展数据图4b，见方法)。这预测了细胞群体通过特定蛋白复合物之间的分子相互作用，并在蜕膜和胎盘中形成潜在的细胞-细胞通信网络(扩展数据图c4-e，补充表3,4)。
图1：母胎界面细胞类型鉴定。
a.早期妊娠蜕膜-胎盘界面。DC,树突细胞;dM,蜕膜巨噬细胞;dS，蜕膜基质细胞;Endo,内皮细胞;上皮腺细胞;F,成纤维细胞;HB,Hofbauer细胞;PV，血管周围细胞;SCT,合胞体滋养层;VCT,绒毛细胞滋养层;EVT,extravillous滋养层。
b:蜕膜、胎盘和母体外周血单核细胞的单细胞转录组分析工作流程。括号内的数字表示被分析的人数。c:胎盘和蜕膜细胞簇。来自10x基因组学和UMAP可视化的Smart-seq2(SS2)scRNA-seq分析。颜色表示细胞类型或状态。蜕膜11例，胎盘5例，血液样本6例。f,胎儿;先天淋巴细胞;l,淋巴;米,孕产妇;p,增殖;M3,产妇巨噬细胞。
d:通过整合Smart-seq2和10xGenomicsT细胞数据，从簇4、8、10和15来自c.TCR,T细胞受体，UMAP可视化T细胞克隆扩张和簇。粘膜相关不变T细胞。
e,c中液滴细胞由组织(上)或基因型(下)来源。紫圈，胎盘中的母细胞;绿色的圆圈，蜕膜中的胎儿细胞。
通过scRNA-seq进行滋养细胞分化
为了研究母体和胎儿细胞在蜕膜—胎盘界面的相互作用，我们首先分析了从胎盘和蜕膜样本中分离出的胎儿滋养细胞:后者包含有侵袭性EVT(扩展数据图5a,b)。与之前的结果16,17一致，我们确定了两种不同的滋养细胞分化途径(图2a)。
正如预期的那样，蜕膜EVT位于轨迹的末端，具有高水平的HLA-G表达，不再表达细胞周期基因(扩展数据图5c)。对于绒毛状细胞滋养细胞，CellPhoneDB预测参与细胞增殖和分化的受体(EGFR、NRP2和MET)与其胎盘中其他细胞表达的相应配体的相互作用。HBEGF,可能与表皮生长因子受体相互作用,Hofbauer表达的细胞,和PGFHGF-theNRP2各自的配体和不同的胎盘纤维母细胞表达的会见的子集(图2b,补充表5)。
相比之下,在EVT分化有upregulation受体参与免疫调节、细胞粘附和入侵,配体的表达的蜕膜细胞(图2b)。例如，ACKR2是母体免疫细胞18产生的炎性细胞因子的诱饵受体，CXCR6是与母体巨噬细胞表达的CXCL16结合的趋化因子受体。
TGFB1基因的表达——其功能是抑制免疫反应19和激活上皮-间充质转化——及其受体在EVT分化时增加。参与上皮-间充质过渡计划的成分在轨迹20末端上调(扩展数据图5d);其中包括PAPPA和PAPPA2，它们编码金属蛋白酶，这些蛋白酶被认为参与了细胞入侵。在妊娠期，PAPPA水平的降低是先兆子痫和胎儿生长受限的生物标志物，这与EVT侵入缺陷有关21。
图2：EVT分化过程中配体受体表达。
a:滋养细胞伪时间序列揭示了EVT和SCT通路。胎盘和蜕膜分离物上富集的EPCAM+和HLA-G+细胞包括在内。11个蜕膜和5个胎盘。
b:小提琴图显示了在假期间改变的、被CellPhoneDB预测为显著的配体-受体对的对数转化、规范化表达水平(EGFR、HBEGF、NRP2、PGF、MET、HGF、ACKR2、CCL5、CXCR6、CXCL16、TGFB1、TGFBR2和TGFBR1)。图1c中的单元用于小提琴图。
两层蜕膜中的基质细胞
EVT最初通过表面上皮进入蜕膜。在这下面是蜕膜海绵，它包含高分泌腺，一般认为在早期为胚胎提供组织营养。标记区分不同蜕膜成纤维细胞数量识别两个集群的血管周的细胞(称为pv和兵)分享的平滑肌标记(MGP)和由不同级别的MCAM杰出,高pv,MMP11,更高的兵(图3,补充表6)。有三个集群的基质细胞(称为dS1、dS2和dS3),所有这些表达DKK1WNT抑制剂。dS1与PV1和PV2共同表达ACTA2和TAGLN，而经典的蜕膜标记泌乳素(prolactin,PRL)和IGFBP1不表达。相比之下，dS2和dS3表达IGFBP1、IGFBP2和IGFBP6，并与最近在vitro22中被描述的蜕膜基质细胞的两个亚群共享标记。dS3亚群表达PRL以及参与甾体生物合成的基因(例如CYP11A1)(扩展数据图6a)。
为了在原位定位不同的血管周围和基质群体，我们使用免疫组织化学和多路单分子荧光原位杂交(smFISH)在鳞茎蜕膜的序列切片上选择标记。这些实验证实了表达ACTA2和MCAM的细胞存在于螺旋动脉的平滑肌中23，并表明MMP11也存在显示PV1和PV2均位于血管周围(图3b)。ACTA2+dS1细胞存在于蜕膜松质的腺体之间，而IGFBP1+、PRL+dS2和dS3细胞位于蜕膜致密组织中(图3c,d，扩展数据图7)。CYP11A1在蜕膜密质中也比在蜕膜松质中表达更丰富(扩展数据图6b)。
我们的CellPhoneDB工具预测，PV1和PV2(例如，ANGPT1和VEGFA)表达的血管生成因子的同源受体位于内皮中(图3e)。EVT首先侵入蜕膜密质，其中dS2和dS3表达高水平的LGALS9和CLEC2D。这些分子可以与它们各自的抑制受体TIM3(也被称为HAVCR2)和KLRB1相互作用，这两种受体由dNKs的亚群表达，使基质能够抑制蜕膜的炎症反应。
蜕膜NK细胞的三种状态
我们确定了三个主要的dNK亚群(dNK1、dNK2和dNK3)，它们共同表达组织常驻标记CD49A(也称为ITGA1)和CD9(扩展数据图8a)。dNK1细胞表达CD39(又称ENTPD1)、CYP26A1和B4GALNT1，而dNK2细胞的定义标记为ANXA1和ITGB2;后者与dNK3细胞共享(图4a，补充表7)。
dNK3细胞表达CD、KLRB1和CD(也称为ITGAE)，但不表达固有淋巴细胞标记物CD(也称为IL7R)(扩展数据图8a)。KIR家族的基因具有多态性和高度同源性，这使得定量分析单个KIR基因的mRNA表达具有挑战性12。
因此，我们开发了“KIRid”方法，该方法使用全长transcriptSmart-seq2数据将每个供体的单细胞reads映射到对应的供体特异性KIR等位基因参考位点(图4b，见方法)。我们发现dNK1细胞表达高水平的吉珥,可以绑定到HLA-C分子:抑制KIR2DL1,KIR2DL2KIR2DL3和激活KIR2DS1KIR2DS4(图4c,补充表8)。
LILRB1,高亲和力受体HLA-G分子的二聚的形式,表示只有dNK1子集。dNK1和dnk2-而不是dnk3-都表达HLA-E分子的激活NKG2C(也被称为KLRC2)和NKG2E(也被称为KLRC3)以及抑制性NKG2A(也被称为KLRC1)受体(图4c)。
这些结果预测了dNK1在EVT识别和响应中的可能作用。为了进一步研究这3个dNK群体，我们利用CD49a(常驻dNKs表达)结合转录组数据(CD39、ITGB2、CD和KIR2DL1)预测的每个dNK子集的标记，通过流式细胞术分析了6个样本(图4d，扩展数据图8b)。
我们通过流式细胞术证实了三个dNK群体的存在以及在dNK1中KIR2DL1的优先表达(图4d，补充表9)。我们通过流式细胞术分选分离的细胞的Giemsa染色分析了dNK亚群的形态(扩展数据图8c)。
与dNK2和dNK3相比，dNK1含有更多的胞质颗粒，这与我们的scRNA-seq数据一致，该亚群中PRF1、GNLY、GZMA和GZMBRNA表达水平较高(图4e)。流式细胞术发现KIR+细胞中的颗粒蛋白(PRF1、GNLY、GZMA和GZMB)表达水平高于KIRdNK细胞(图4f)。dNK1细胞也表达高水平的参与糖酵解的酶(图4g)。
因此，dNK1细胞具有糖酵解代谢活跃的特点，且KIR基因(KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3)、LILRB1和细胞质颗粒蛋白表达较高，提示与EVT相互作用特别明显的是dNK1细胞。首次怀孕与表达LILRB的dNK细胞比例较低、出生体重较低以及诸如子痫前期a25等疾病的发生率增加有关。成熟的“记忆”自然杀伤细胞的代谢组学编程也发生在慢性人类巨细胞病*感染中26。
总之，这些发现与第一次怀孕时dNK1细胞的“启动”是一致的，这样它们就能在随后的怀孕中对植入的胎盘做出更有效的反应。
图3
基质在两层不同蜕膜层中的分布。
a，显示所选基因在血管周和蜕膜基质细胞中的相对表达(z-score)的热图(n=11个蜕膜细胞);调整后的P值0.1;Wilcoxon秩和检验与Bonferroni校正)。
b，螺旋动脉蜕膜连续切片的免疫组化，CD34(内皮细胞)、ACTA2(PV细胞和dS1细胞)、MCAM(PV1细胞)和MMP11(PV2细胞)染色(n=2个生物复制)。标尺，尺m。
c,ACTA2染色的蜕膜切片的免疫组化，区分deciduaspongiosa的ACTA2+dS1和decidua